Il quadro rappresenta il momento in cui il Cristo chiama Matteo all’apostolato.
Nella parte superiore vi è un’area vuota, occupata solo da una finestra, mentre la parte inferiore ritrae i soggetti.
Gesù con il braccio teso indica Matteo e San Pietro, visto come la personificazione della Chiesa cattolica mediatrice tra Dio e l’uomo, ripete il gesto.

A eccezione di Gesù e di San Pietro, i personaggi sono vestiti alla moda dell’epoca di Caravaggio e i loro visi, di modelli scelti tra la gente comune, sono raffigurati senza alcuna idealizzazione.
Il senso è che la chiamata riguarda tutte le epoche e tutti gli uomini, pur lasciando ciascuno libero di aderire o meno al Mistero della Rivelazione.
A differenza del vecchio con gli occhiali e del giovane alla sua destra, che rimangono intenti nelle loro occupazioni con il capo chino, il ragazzo di spalle in primo piano, elegante nella sua giubba dalle maniche rigate, vedendo Gesù, con un gesto spavaldo e ispirato, è quasi pronto ad alzarsi per andargli incontro.

La grande protagonista dell’opera è la luce.
La scena è immersa in una fitta penombra tagliata da squarci dai quali emergono visi, mani o parti dell’abbigliamento, rendendo quasi invisibile tutto il resto.
La luce assurge a simbolo della Grazia divina e infatti non proviene dalla finestra ma dalle spalle del Cristo.

Una curiosità: la radiografia del quadro ha evidenziato come la figura di San Pietro sia stata aggiunta in un secondo momento.